Caracterización funcional mediante CRISPR-Cas9 de CRZ1 en la vía calmodulinacalcineurina en Candida auris para el desarrollo de dianas terapéuticas

Abstract

Candida auris es un patógeno fúngico emergente y multirresistente, clasificado por la OMS como una prioridad crítica y con tasas de mortalidad que pueden alcanzar el 30-60%, frente al cual urge identificar nuevas dianas terapéuticas. La vía de señalización calmodulinacalcineurina y su efector, el factor de transcripción Crz1, regulan la termotolerancia, la integridad de la pared celular y la resistencia a antifúngicos, lo que convierte a CRZ1 en una diana de interés. Este Trabajo de Fin de Grado tuvo como objetivo caracterizar funcionalmente CRZ1 en C. auris mediante edición génica con CRISPR-Cas9 y evaluar, mediante análisis bioinformático, su conservación evolutiva y su potencial como diana terapéutica. Para ello se compararon secuencias de CRZ1 de trece especies fúngicas a nivel nucleotídico y proteico, realizando alineamientos múltiples, reconstrucción filogenética, matrices de identidad, análisis del dominio de dedos de zinc mediante logo de secuencia y proyección de la conservación por residuo sobre el modelo estructural AlphaFold. En paralelo, se abordó experimentalmente la deleción de CRZ1 mediante un sistema clásico de recombinación homóloga y la preparación del sistema CRISPR-Cas9. El análisis reveló que Crz1 presenta una organización modular, el dominio de unión a ADN de tipo C2H2 está totalmente conservado entre los cinco clados de C. auris (100%) y se mantiene conservado a escala pan-fúngica (70-93%), mientras que el resto de la proteína diverge. La parte experimental permitió optimizar las condiciones de amplificación de los componentes del cassette y verificar los plásmidos, quedando pendiente la obtención de los mutantes. En conjunto, el trabajo respalda a CRZ1 y a la vía calmodulinacalcineurina como una diana antifúngica prometedora y potencialmente de amplio espectro.